Phương pháp đếm tế bào dòng chảy trong chẩn đoán rối loạn miễn dịch bẩm sinh

GIỚI THIỆU

CÁC KHÍA CẠNH KỸ THUẬT

Các thành phần và chức năng của máy đo tế bào dòng chảy

Một máy đo tế bào dòng chảy cơ bản bao gồm năm thành phần chính: một buồng dòng chảy (nơi các tế bào chảy qua), một laser, các thành phần quang học, các đầu dò để khuếch đại tín hiệu, và một hệ thống điện tử/máy tính. Với năm thành phần này, máy đo tế bào dòng chảy có khả năng thực hiện các phép đo tức thời bằng cách cho hàng nghìn tế bào đi qua chùm tia laser và thu nhận ánh sáng phát ra từ mỗi tế bào khi nó đi qua điểm kiểm tra. Bất kỳ tế bào hoặc hạt lơ lửng nào có kích thước từ 0,2 đến 150 micromet đều phù hợp để phân tích. Các phân tích để xác định các đặc điểm của tế bào, chẳng hạn như kích thước, độ hạt, khả năng sống và kiểu hình miễn dịch (immunophenotyping), là các loại nghiên cứu phổ biến nhất.

Các loại mẫu

Về mặt lý thuyết, bất kỳ mẫu sinh học nào cũng có thể được phân tích bằng tế bào học dòng chảy (flow cytometry), mặc dù máu ngoại vi là mẫu được phân tích phổ biến nhất. Tùy thuộc vào xét nghiệm cụ thể, có thể sử dụng máu toàn phần, hoặc có thể cô lập và sử dụng các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) để phân tích. Các mẫu tủy xương được sử dụng trong quá trình kiểm tra nghi ngờ bệnh bạch cầu. Các nguồn sinh học khác đã được sử dụng cho tế bào học dòng chảy, chẳng hạn như dịch não tủy hoặc rửa phế g, mặc dù việc thiếu các giá trị bình thường đã được công bố từ các vị trí sinh học này có thể gây khó khăn cho việc diễn giải.

Miễn dịch kiểu hình

Miễn dịch kiểu hình là một kỹ thuật được sử dụng để xác định thành phần của các quần thể tế bào bằng cách phát hiện biểu hiện protein của tế bào. Miễn dịch kiểu hình sử dụng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên quan tâm được liên hợp với một hợp chất huỳnh quang được gọi là fluorophore hoặc fluorochrome (hình 1). Các hợp chất huỳnh quang này hấp thụ năng lượng từ nguồn laser, khiến electron được nâng lên mức năng lượng cao hơn. Electron bị kích thích nhanh chóng trở về trạng thái cơ bản, phát ra năng lượng dư thừa dưới dạng photon ánh sáng có bước sóng đặc trưng được phát hiện bởi máy đo tế bào dòng chảy.

Thu thập và phân tích dữ liệu

Mỗi tế bào được phân tích bằng các thông số sau khi huyền phù tế bào đi qua máy đo tế bào dòng chảy (flow cytometer):

Phân tế bào khối

Một công nghệ đã được phát triển kết hợp lưu lượng tế bào với phổ khối, được gọi là phân tế bào khối hoặc đo tế bào theo thời gian bay (CyTOF) 1. Công nghệ này sử dụng các kháng thể được gắn nhãn để đánh giá các quần thể tế bào tương tự như các phép đo dựa trên huỳnh quang. Tuy nhiên, trong CyTOF, các kháng thể được gắn nhãn bằng các ion kim loại nặng và được kiểm tra bằng phổ khối. Ưu điểm của kỹ thuật này là kết quả đo dựa trên số nguyên tử của kim loại nặng, và có ít sự chồng lấp giữa các đồng vị. Do đó, một số lượng lớn kháng thể có thể được sử dụng đồng thời, cho phép phân tích hơn 40 mục tiêu trên mỗi tế bào. CyTOF chưa phổ biến trong lâm sàng nhưng có lẽ sẽ trở nên nổi bật hơn trong tương lai 2.

SỬ DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN CÁC RỐI LOẠN MIỄN DỊCH BẨM SINH

Chỉ định sử dụng

IEI là một nhóm rối loạn, thường di truyền, có thể ảnh hưởng đến các tế bào của hệ miễn dịch bẩm sinh hoặc thích ứng 3,4. Đo lưu lượng kế (Flow cytometry) là một công cụ thiết yếu trong chẩn đoán suy giảm miễn dịch. Việc sử dụng nó không giới hạn ở IEI, vì phương pháp này có thể được sử dụng để đánh giá hệ miễn dịch trong các trường hợp suy giảm miễn dịch thứ phát hoặc mắc phải, chẳng hạn như những trường hợp có thể xảy ra trong quá trình nhiễm virus (ví dụ: nhiễm vi-rút suy giảm miễn dịch người [HIV]), sau ghép tủy xương, trong hóa trị, và trong quá trình ức chế miễn dịch đối với tự miễn hệ thống.

Rối loạn số lượng tế bào lympho

Công thức máu toàn phần (CBC) với phân tích tế bào là bước đầu tiên thiết yếu trong quá trình chẩn đoán IEI nghi ngờ, mặc dù xét nghiệm này không xác định được các phân nhóm tế bào lympho khác nhau. Đo quang kế (Flow cytometry) cho phép đếm định tính và định lượng các phân nhóm tế bào lympho, bao gồm tế bào T dương tính với CD4 và CD8, tế bào B, và tế bào tiêu diệt tự nhiên (NK) (hình 4).

Tế bào T

Số lượng tế bào T ngây thơ giảm đáng kể, có hoặc không kèm theo số lượng tế bào B và NK giảm, là dấu hiệu đặc trưng của suy giảm miễn dịch kết hợp nặng (SCID) (hình 5). SCID có thể được chia thành nhiều loại phụ dựa trên các loại tế bào bị thiếu hụt. Ví dụ, các biến thể gây bệnh trong tiểu đơn vị CD3, CD45, hoặc thụ thể alpha interleukin (IL-7-R-alpha) gây ra SCID T-B+NK+. Các biến thể gây bệnh trong gen tái tổ hợp hoạt hóa (RAG) hoặc Artemis gây ra SCID T-B-NK+. Các biến thể gây bệnh trong adenosine deaminase (ADA) gây ra SCID T-B-NK-. Các biến thể gây bệnh trong gen Janus kinase 3 (JAK3) hoặc chuỗi gamma của thụ thể IL-2 (IL-2-R-gamma) gây ra SCID T-B+NK-. (Xem “Suy giảm miễn dịch kết hợp nặng (SCID): Tổng quan” và “Suy giảm miễn dịch kết hợp nặng (SCID): Các khiếm khuyết cụ thể”.)

Tế bào T điều hòa

Rối loạn điều hòa miễn dịch, đa nội tiết bệnh, viêm ruột, liên kết X (ΙPEX) là một rối loạn gây ra các biểu hiện tự miễn dịch lan rộng, thường bắt đầu không lâu sau khi sinh. Các biến thể gây bệnh trong gen forkhead box P3 (FOXP3) là nguyên nhân gây ra ΙPEX. Foxp3 là một yếu tố phiên mã rất quan trọng đối với sự phát triển, khả năng sống sót và chức năng tác động của các tế bào T điều hòa (Treg), vốn cần thiết trong việc duy trì dung nạp và ngăn ngừa tự miễn dịch 6. Các tế bào Treg chiếm khoảng 5 đến 10 phần trăm tế bào T CD4+ trong máu ngoại vi. Các tế bào Treg biểu hiện mức độ cao CD25, tiểu đơn vị gắn kết ái lực cao của thụ thể IL-2, và mức độ thấp CD127, tiểu đơn vị alpha của thụ thể IL-7 7. Việc sử dụng kháng thể đối với CD4, CD25, CD127 và Foxp3 cho phép định lượng các tế bào Treg trong máu ngoại vi, vốn thường giảm ở bệnh nhân ΙPEX (hình 6). Sự hiện diện của các tế bào dương tính với Foxp3 không loại trừ ΙPEX, vì một số biến thể gây bệnh làm giảm hoặc loại bỏ chức năng Foxp3 nhưng không làm mất ổn định protein. Phân tích trình tự của gen FOXP3 nên được thực hiện nếu tiền sử lâm sàng gợi ý ΙPEX nhưng các tế bào dương tính với Foxp3 lại có mặt trên máy đo tế bào dòng chảy. Các bệnh giống ΙPEX cũng có thể do thiếu hụt CD25 hoặc signal transducer and activator of transcription 5b (ЅTAT5b), các tiểu đơn vị truyền tín hiệu quan trọng của thụ thể IL-2 8,9. (Xem “IPEX: Rối loạn điều hòa miễn dịch, đa nội tiết bệnh, viêm ruột, liên kết X”.)

Tế bào T hỗ trợ g

Sự hình thành trung tâm mầm (GC) trong các cơ quan lympho thứ cấp cho thấy sự mở rộng dòng tế bào B, biến đổi siêu vị trí soma (SHM) và tái tổ hợp chuyển lớp (CSR) sau khi các tế bào B được các tế bào T hỗ trợ kích hoạt đúng cách. Một GC bao gồm ba loại tế bào: tế bào B, tế bào gai g (FDC), và tế bào T hỗ trợ g (Tfh). Tế bào Tfh di chuyển đến vùng g và cung cấp các tín hiệu đồng kích thích và cytokine cho các tế bào B trong GC, sau đó các tế bào B này tăng sinh và trải qua SHM và CSR. Tfh được đặc trưng bởi việc biểu hiện thụ thể chemokine motif C-X-C 5 (CXCR5, trong đó C = cysteine và X = bất kỳ axit amin nào; còn được gọi là CD185 (hình 7)), cho phép các tế bào này di chuyển về phía gradient ligand chemokine motif cytosine-X-cytosine 13 (CXCL13) do FDC tiết ra 10,11. Tfh được phát hiện với số lượng tăng cao ở bệnh nhân tự miễn hệ thống 12 và ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch biến đổi phổ biến. Tế bào Tfh giảm trong hội chứng tăng immunoglobulin E (ΗIES) do các biến thể gây bệnh của yếu tố phiên mã kích hoạt và truyền tín hiệu 3 (ЅTAT3) 13. (Xem “Hội chứng tăng immunoglobulin E di truyền trội trên nhiễm sắc thể”, phần về ‘Khuyết tật tế bào T’.)

Tế bào B

Giảm nặng tất cả các loại immunoglobulin huyết thanh cùng với sự suy giảm sâu hoặc vắng mặt tế bào B là những dấu hiệu đặc trưng của các dạng agammaglobulinemia bẩm sinh. Agammaglobulinemia liên kết X (XLA) là dạng agammaglobulinemia bẩm sinh phổ biến nhất, chiếm khoảng 85 phần trăm bệnh nhân. Bệnh nhân XLA xuất hiện vào thời thơ ấu với các nhiễm trùng tái phát, đặc biệt là do vi khuẩn bao thể và nhiễm trùng enterovirus mạn tính. XԼA là do các biến thể gây bệnh trong gen Bruton tyrosine kinase (BTK), dẫn đến tắc nghẽn phát triển ở giai đoạn tiền B của sự phát triển tế bào B trong tủy xương, dẫn đến thiếu hụt gần như hoàn toàn tất cả các tế bào B trưởng thành. Việc đếm tế bào B được thực hiện bằng cách sử dụng các dấu ấn toàn bộ tế bào B CD19 hoặc CD20. Số lượng tế bào B thường giảm sâu trong XԼA. Sự biểu hiện nội bào của protein BTK có thể được phân tích trong monocyte để xác nhận mất biểu hiện protein BTK vì bệnh nhân XԼA thường thiếu tế bào B (hình 8). Nữ giới mang alen đột biến biểu hiện số lượng tế bào B bình thường và mức độ biểu hiện BTK bình thường trong tế bào B do sự bất hoạt nhiễm sắc thể X không ngẫu nhiên, nhưng chỉ khoảng 50 phần trăm monocyte của họ biểu hiện BTK. Do đó, tỷ lệ monocyte biểu hiện BTK có thể được sử dụng để xác định tình trạng mang trong người thân của trẻ bị ảnh hưởng 14,15. BTK cũng được biểu hiện trong tiểu cầu, và sự biểu hiện BTK của tiểu cầu có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện của protein này khi không có tế bào B 16. (Xem “Agammaglobulinemia”.)

Tế bào tiêu diệt tự nhiên

Tế bào NK là một quần thể lympho bẩm sinh thể hiện độc tính tế bào đối với các tế bào bị nhiễm virus và tế bào khối u. Không giống như tế bào CD8, vốn cũng thể hiện độc tính tế bào đối với khối u và virus, tế bào NK thể hiện độc tính tế bào tự phát mà không cần kích hoạt kháng nguyên. Tế bào NK biểu hiện các dấu ấn dòng tế bào độc đáo như CD56, cũng như CD16, một thụ thể Fc điều hòa độc tính tế bào phụ thuộc kháng thể. Hầu hết các tế bào NK không biểu hiện CD3, mặc dù có một quần thể tế bào nhỏ gọi là tế bào NKT là CD3+CD56+. Thiếu hụt tế bào NK có thể xảy ra do thiếu tế bào NK (ví dụ: thiếu thành phần phức hợp duy trì vi nhiễm sắc thể tối thiểu [MCM4] hoặc protein liên kết GATA 2 [GATA2]) hoặc thiếu chức năng NK (ví dụ: khiếm khuyết ở CD16) 18-21. Những bệnh nhân này dễ bị nhiễm virus herpes. Khiếm khuyết trong perforin và các gen khác liên quan đến bộ máy độc tế bào cũng dẫn đến việc tiêu diệt NK bị lỗi, cũng như tiêu diệt CD8 bị lỗi. Những bệnh nhân này có nguy cơ mắc bệnh lymphohistiocytosis thực bào (HLH). (Xem ‘Khiếm khuyết tế bào lympho độc tế bào’ bên dưới và “Hội chứng thiếu hụt tế bào NK: Biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán”.)

Các khiếm khuyết trong chức năng tế bào B

Các khiếm khuyết chức năng của tế bào B được thấy trong suy giảm miễn dịch biến đổi phổ biến (CVІD) được xem xét dưới đây.

Thiếu máu miễn dịch biến đổi phổ biến

CVID là một bệnh thiếu hụt miễn dịch tương đối phổ biến, thường biểu hiện bằng các nhiễm trùng đường hô hấp trên và dưới và đường tiêu hóa. Thường xuyên, bệnh nhân CVID cũng mắc các rối loạn điều hòa miễn dịch (ví dụ: giảm tế bào máu tự miễn, bệnh viêm ruột, bệnh phổi kẽ). Tiêu chí chẩn đoán CVID bao gồm mức immunoglobulin G (IgG) điều chỉnh theo tuổi thấp và mức immunoglobulin A (IgA) hoặc immunoglobulin M (IgM) thấp, đáp ứng kháng thể đặc hiệu bị suy giảm sau tiêm chủng, và loại trừ các nguyên nhân khác gây giảm globulin máu ở bệnh nhân trên hai tuổi 22. (Xem “Biểu hiện lâm sàng, dịch tễ học và chẩn đoán thiếu máu miễn dịch biến đổi phổ biến ở người lớn” và “Thiếu máu miễn dịch biến đổi phổ biến ở trẻ em”.)

Khiếm khuyết chức năng tế bào T

Chức năng tế bào T có thể được đánh giá bằng nhiều xét nghiệm khác nhau sử dụng lưu lượng kế (flow cytometry). Khi được kích hoạt, tế bào T tăng sinh và biệt hóa thành các tế bào tiết cytokine (CD4) hoặc tế bào độc tế bào (CD8). Các tế bào CD4 có thể được biệt hóa thêm thành các phân nhóm khác nhau dựa trên loại cytokine mà chúng biểu hiện, chẳng hạn như tế bào hỗ trợ T loại 1 (Th1) biểu hiện interferon (IFN) gamma, tế bào Th2 biểu hiện IL-4, và tế bào Th17 biểu hiện IL-17. Các tế bào CD4 Tfh cũng rất quan trọng đối với việc kích thích tế bào B, điều này chúng thực hiện thông qua các phân tử bề mặt tế bào (ví dụ: CD40L) và cytokine.

Bệnh SCID hoặc bệnh giống SCID

Mất hoàn toàn tế bào T dẫn đến suy giảm miễn dịch kết hợp nặng (SCID) (xem ‘T cells’ ở trên), nhưng, trong một số trường hợp SCID hoặc bệnh giống SCID, có một số lượng đáng kể tế bào T không tăng sinh hoặc không hoạt động (ví dụ, thiếu hụt phân tử tương tác màng nền 1 [STIM1] và Orai1). Việc đánh giá các bệnh nhân này yêu cầu đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào T. Trong lịch sử, việc tích hợp thymidine tritio đã được sử dụng để đo sự tăng sinh của tế bào T, nhưng điều này cũng có thể được thực hiện bằng đo tế bào dòng chảy (flow cytometry). Một cách để kiểm tra điều này là gắn nhãn tế bào bằng một phân tử huỳnh quang, chẳng hạn như carboxyfluorescein succinimidyl ester (CSFE), và sau đó kích hoạt tế bào bằng các mitogen tế bào T 26. Khi tế bào phân chia, lượng huỳnh quang giảm đi một nửa, điều này có thể được đo bằng đo tế bào dòng chảy. Một phương pháp thay thế là sử dụng các chất tương tự thymidine được gắn nhãn huỳnh quang, chẳng hạn như BrdU hoặc EdU, để đo sự tăng sinh. (Xem “Combined immunodeficiencies: An overview”.)

Hội chứng Hyperimmunoglobulin M

Hội chứng Hyperimmunoglobulin M (HIGM) được đặc trưng bởi các nhiễm trùng tái phát và mức rất thấp của IgG huyết thanh, immunoglobulin E (IgE), và IgA, với mức IgM bình thường hoặc tăng cao. Dạng HIGM phổ biến nhất là hội chứng HIGM liên kết với X (XΗΙM), gây ra bởi các biến thể gây bệnh trong gen phối tử CD40 (CD40Լ, còn gọi là CD154). CD40Լ được biểu hiện tạm thời khi tế bào T CD4+ được kích hoạt, sau đó tương tác với CD40 trên tế bào B, dẫn đến kích hoạt tế bào B, tăng sinh, tái tổ hợp chuyển lớp immunoglobulin và tăng độ ái lực. Sự biểu hiện bề mặt của CD40Լ trên tế bào T CD4+ có thể được đo bằng cách kích hoạt *in vitro* máu ngoại vi bằng phorbol ester (ví dụ: phorbol 12-myristate 12-acetate [PMA]) và ionophore canxi, những chất này gây ra sự biểu hiện của CD40Լ (hình 11). Việc không phát hiện CD40Լ trên các tế bào được kích hoạt được sử dụng làm xét nghiệm đo tế bào dòng chảy sàng lọc để chẩn đoán XΗΙM 27. Ngoài ra, sự biểu hiện của CD40 trên tế bào B cũng có thể được phân tích vì sự biểu hiện CD40 bị khiếm khuyết được biết là một trong những nguyên nhân gây ra hội chứng HIGM lặn tự thể (AR-HIGM) (hình 11). Trong một tỷ lệ nhỏ các trường hợp XNΙM, CD40L được biểu hiện trên tế bào T được kích hoạt nhưng không thể liên kết với CD40 do đột biến sai nghĩa. Trong những trường hợp này, các xét nghiệm liên kết CD40L-CD40 chức năng có thể được thực hiện bằng đo tế bào dòng chảy 28.

Hội chứng lympho tăng sinh tự miễn

Hội chứng lympho tăng sinh tự miễn (ALPS), còn được gọi là hội chứng Canale-Smith, là do các khuyết tật di truyền trong các protein liên quan đến con đường apoptosis qua trung gian Fas. Bệnh nhân ALPS có các triệu chứng như hạch to, gan lách to và giảm tế bào máu tự miễn, và có nguy cơ cao phát triển u lympho 29. ALPS được phân loại thành các phân nhóm Ia, Ib, IIa, IIb do các biến thể gây bệnh gen trong Fas/CD95, phối tử Fas (FasԼ), caspase10 và caspase8, tương ứng. Bình thường, dưới 1 phần trăm tế bào T biểu hiện các chuỗi alpha và beta của thụ thể tế bào T (TCR) không biểu hiện các co-thụ thể CD4 hoặc CD8. Các tế bào này được gọi là tế bào T âm tính kép (DNTs). Trong ALPS, số lượng DNTs TCR alpha beta tăng lên (hình 12). Ngoài ra, các tế bào DNT TCR alpha beta này còn đồng biểu hiện kháng nguyên tế bào B B220. Hội chứng Evans có các đặc điểm của ALPS (ví dụ: giảm tế bào máu tự miễn); do đó, điều quan trọng là phải loại trừ ALPS trong rối loạn này 30. (Xem “Hội chứng lympho tăng sinh tự miễn (ALPS): Dịch tễ học và sinh bệnh học” và “Hội chứng lympho tăng sinh tự miễn (ALPS): Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán” và “Apoptosis và bệnh tự miễn”, phần về ‘Hội chứng lympho tăng sinh tự miễn’ và “Thiếu máu tán huyết tự miễn (AIHA) ở trẻ em: Phân loại, đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán”, phần về ‘Hội chứng Evans’.)

Hội chứng tăng immunoglobulin E (HIES)

HIES trội nhiễm sắc thể tự thân (AD) được đặc trưng bởi các nhiễm trùng phổi, áp xe tụ cầu, chàm, các bất thường về xương và mô liên kết, và mức IgE huyết thanh tăng cao. Các khiếm khuyết trong NΙES là do các biến thể gây bệnh missense trong yếu tố phiên mã ЅTAT3, yếu tố này cần thiết để kích thích tế bào T CD4+ sản xuất IL-17a, một cytokine quan trọng trong việc tạo ra các phản ứng miễn dịch hiệu quả đối với vi khuẩn và nấm 31. Các biến thể gây bệnh này được di truyền theo kiểu AD do tác dụng âm trội của protein đột biến. Một xét nghiệm chức năng dựa trên lưu lượng kế đo khả năng tổng hợp IL-17a của tế bào T có thể được sử dụng để sàng lọc rối loạn này (hình 13). Trong xét nghiệm này, các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMCs) được kích thích bằng phorbol ester (PMA) và ionophore canxi trong sự hiện diện của các phân tử (ví dụ: brefeldin A) ngăn chặn quá trình exocytosis của IL-17a. Sau vài giờ, các tế bào được nhuộm bằng kháng thể đặc hiệu IL-17a trong sự hiện diện của chất tẩy rửa cho phép nhuộm nội bào IL-17a. Việc sản xuất IL-17a trong xét nghiệm này bị suy giảm ở bệnh nhân mắc hội chứng HIES AD 32. Tỷ lệ thấp các tế bào T sản xuất IL-17 không đặc hiệu cho HIES AD, vì điều này cũng có thể thấy trong các rối loạn dị ứng 32. Các bất thường xét nghiệm khác trong ΗІEЅ bao gồm tỷ lệ giảm tế bào Tfh như đã mô tả ở trên. (Xem “Hội chứng tăng immunoglobulin E trội nhiễm sắc thể tự thân” và ‘Tế bào T hỗ trợ g’ ở trên.)

Hội chứng lympho tăng sinh liên kết X, loại 1 và loại 2

Hội chứng lympho tăng sinh liên kết X loại 1 (XLP-1) và Hội chứng lympho tăng sinh liên kết X loại 2 (XLP-2) là những rối loạn liên kết X hiếm gặp, có thể biểu hiện bằng NLH, thường xảy ra sau nhiễm virus Epstein-Barr (EBV). XLP-1 là do các biến thể gây bệnh trong gen Src homology 2 domain protein 1A (SH2D1A) mã hóa protein liên kết (SAP) của phân tử hoạt hóa tế bào lympho truyền tín hiệu (SLAM), trong khi XLP-2 là do các biến thể gây bệnh trong gen baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat-containing protein 4 (BIRC4) mã hóa protein ức chế apoptosis liên kết X (XIAP). Cả XLP-1 và XLP-2 đều có thể biểu hiện bằng tình trạng giảm globulin máu. XLP-1 cũng liên quan đến u lympho liên quan đến EBV. XLP-2 và người mang gen BIRC4 đột biến có nguy cơ mắc bệnh viêm ruột. Những bệnh IEI đe dọa tính mạng này có thể được chữa khỏi bằng ghép tế bào máu. Giảm hoặc mất biểu hiện protein SAP hoặc XIAP trong tế bào lympho có thể được sử dụng để sàng lọc XLP-1 và XLP-2 tương ứng (hình 14) 33,34. Ngoài ra, xét nghiệm chức năng protein XIAP có thể được thực hiện bằng cách kích thích monocytes bằng muramyl dipeptide và đo yếu tố hoại tử khối u (TNF) alpha nội bào, điều này đòi hỏi XIAP chức năng 35. (Xem “bệnh lympho tăng sinh liên kết X” và “Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh lymphohistiocytosis thực bào”, phần ‘Xét nghiệm chuyên sâu’.)

Hội chứng Wiskott-Aldrich

Hội chứng Wiskott-Aldrich (WAS) là một rối loạn bẩm sinh, liên kết với nhiễm sắc thể X, đặc trưng bởi bộ ba các triệu chứng: xuất huyết do giảm tiểu cầu, chàm và nhiễm trùng thường xuyên. Có sự chồng lấp triệu chứng ở bệnh nhân WAS với một bệnh liên quan chặt chẽ, là giảm tiểu cầu liên kết X và giảm bạch cầu trung tính liên kết X bẩm sinh 36. Protein WAS (WASp) quan trọng cho quá trình trùng hợp actin của các tế bào miễn dịch khi được kích hoạt và có thể ảnh hưởng đến cả phản ứng tế bào T và tế bào B. Biểu hiện WASp kém trong các tế bào lympho là dấu hiệu của WAS (hình 15) 37. Phân tích tế bào dòng chảy cũng có thể được sử dụng để đánh giá tình trạng mang gen dị hợp tử ở các bà mẹ có con trai bị ảnh hưởng 38. (Xem “Hội chứng Wiskott-Aldrich”.)

Thiếu hụt tế bào lympho gây độc tế bào

Tế bào NK và T CD8+ là các tế bào gây độc, có khả năng nhận biết và tiêu diệt các tế bào bị nhiễm virus và tế bào khối u. Khi được kích hoạt, các hạt gây độc tế bào di chuyển về phía điểm tiếp xúc với tế bào đích và hợp nhất với màng plasma, giải phóng các phân tử gây độc là perforin và granzymes vào không gian liên bào. Quá trình này được hỗ trợ bởi nhiều protein bao gồm Rab27a, Munc13-4, Syntaxin 11 và Lyst1. Perforin sau đó tạo điều kiện vận chuyển granzymes vào tế bào đích và khởi phát quá trình apoptosis. Các biến thể gây bệnh di truyền trong các protein liên quan đến quá trình này có thể dẫn đến HLH khi phản ứng với nhiễm virus, đặc biệt là cytomegalovirus và EBV 39. Phân tích tế bào dòng chảy có thể được sử dụng để phát hiện sự thiếu hụt các phân tử này, cũng như để kiểm tra các khiếm khuyết trong việc tiêu diệt các tế bào đích. (Xem “Hội chứng thiếu hụt tế bào NK: Biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán” và “Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh lymphohistiocytosis thực bào máu” và “Điều trị và tiên lượng bệnh lymphohistiocytosis thực bào máu”.)

Xét nghiệm độc tính tế bào

Con đường độc tế bào có thể được đánh giá bằng xét nghiệm độc tính tế bào dựa trên tế bào NK bằng lưu lượng kế vì tế bào NK thể hiện khả năng tiêu diệt tế bào khối u mà không cần hoạt hóa trước hoặc thao tác khác. Tóm lại, một dòng tế bào khối u mục tiêu (K562) được gắn bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (carboxyfluorescein succinimidyl ester [CFSE]) để các tế bào mục tiêu này có thể được xác định từ các tế bào hiệu ứng của đối tượng. Các tế bào mục tiêu này được ủ với tỷ lệ ngày càng tăng của PBMCs chứa tế bào NK. Khi bị apoptosis, các tế bào mục tiêu co lại (thể hiện bằng việc giảm kích thước tế bào) và hấp thụ thuốc nhuộm huỳnh quang (7-aminoactinomycin D [7-AAD]), chất này xen kẽ vào DNA của các tế bào bị apoptosis (hình 16). Việc tiêu diệt tế bào hiệu ứng bị lỗi cho thấy rối loạn chức năng của tế bào lympho độc tế bào và các biến thể có thể có trong gen ở con đường độc tế bào đã mô tả ở trên. Sau đó, lưu lượng kế có thể được sử dụng để phân tích sự biểu hiện của các phân tử độc tế bào (ví dụ: perforin), cũng như xác định xem có khiếm khuyết nào trong quá trình giải hạt của các tế bào này hay không. (Xem “Hội chứng thiếu hụt tế bào NK: Biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán”.)

Biểu hiện các phân tử độc tế bào và xét nghiệm khử hạt

Giảm độc tế bào là dấu hiệu đặc trưng của HLH. Sự biểu hiện của perforin được phát hiện bằng lưu lượng kế nội bào là một phân tích quan trọng trong việc đánh giá bệnh nhân bị giảm độc tế bào vì 20 đến 30 phần trăm bệnh nhân NLN có khiếm khuyết trong biểu hiện perforin (hình 17) 40,41. Phân tích đột biến gen nên được thực hiện nếu biểu hiện perforin bình thường để kiểm tra các biến thể gây bệnh khác liên quan đến HLN (Rab27a, Munc13-4, và Lyst1) 39,42. Các protein này rất quan trọng đối với sự vận chuyển và hợp nhất của các hạt độc tế bào với màng plasma. Đo lường sự biểu hiện bề mặt của CD107a (protein màng liên kết lysosome 1 [LAMP-1]) bằng lưu lượng kế có thể được sử dụng để đánh giá con đường độc tế bào vì protein này được hiển thị trên bề mặt tế bào khi các hạt độc tế bào hợp nhất với màng plasma. Bình thường, khoảng 5 đến 15 phần trăm tế bào NK biểu hiện CD107a trên bề mặt tế bào khi tiếp xúc với các tế bào đích (hình 18). (Xem “Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh lymphohistiocytosis thực bào máu”.)

Khuyết tật hệ miễn dịch bẩm sinh

Khuyết tật bạch cầu trung tính liên quan đến nhiễm trùng da, áp xe, hình thành mủ kém và các khuyết tật trong lành vết thương. Bạch cầu trung tính phải bám vào nội mô tại các vị trí nhiễm trùng, di chuyển về phía các sinh vật gây nhiễm trùng, và sau đó thực bào và tiêu diệt các sinh vật này. Khuyết tật ở bất kỳ bước nào dọc theo con đường này có thể dẫn đến bệnh tật. (Xem “Rối loạn sơ cấp về số lượng và/hoặc chức năng của thực bào: Tổng quan”.)

Thiếu hụt bám dính bạch cầu

Sự di chuyển của bạch cầu từ khoang mạch máu đến vị trí viêm nhiễm hoạt động liên quan đến sự thoát mạch của bạch cầu trung tính bằng cách lăn và bám vào bề mặt tế bào nội mô. Thiếu hụt bám dính bạch cầu loại 1 (LAD I) là một rối loạn di truyền liên kết nhiễm sắc thể X do các biến thể gây bệnh trong integrin beta-2 CD18. LAD II, cũng là một rối loạn di truyền liên kết nhiễm sắc thể X, xảy ra do các biến thể gây bệnh trong chất vận chuyển fucose gây thiếu hụt Sialyl Lewis X/CD15a. Cả CD15 và CD18 đều tham gia vào quá trình lăn và bám dính chắc chắn của bạch cầu trung tính vào nội mô. Phân tích tế bào dòng chảy có thể đánh giá mức độ biểu hiện của CD18 và CD15 và nên được kiểm tra ở bất kỳ trẻ sơ sinh nào bị khó lành vết thương, áp xe hoặc nhiễm trùng da (hình 19). LAD III gây ra bởi các khiếm khuyết trong protein nội bào Kindlin 3, và bệnh nhân mắc cả nhiễm trùng lẫn rối loạn chảy máu vì protein này tham gia vào việc truyền tín hiệu để kích hoạt các protein integrin. LAD III được chẩn đoán thông qua xét nghiệm di truyền và nghiên cứu tiểu cầu. (Xem “Thiếu hụt bám dính bạch cầu”.)

Bệnh hạt mạn tính

Bệnh hạt mạn tính (CGD) là một bệnh suy giảm miễn dịch hiếm gặp nhưng là một trong những khuyết tật thực bào phổ biến nhất. CGD được đặc trưng bởi sự vắng mặt hoặc giảm nghiêm trọng của phản ứng bùng nổ oxy hóa của bạch cầu trung tính, vốn cần thiết để tạo ra các phân tử, chẳng hạn như superoxide, có vai trò quan trọng trong việc tiêu diệt vi sinh vật. Bệnh nhân CGD mắc nhiều loại nhiễm trùng tái phát khác nhau, thường do vi khuẩn và nấm dương catalase gây ra. Trong CGD, việc tiêu diệt vi sinh vật bị khiếm khuyết do các biến thể gây bệnh trong một trong bốn thành phần đã biết của phức hợp NADPH oxidase nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH). Các bệnh này liên kết với nhiễm sắc thể X (gp91phox/CYBB) hoặc liên kết Y (AR) (p22phox/CYBA, p47phox/NCF1, p67phox/NCF2). (Xem “Bệnh hạt mạn tính: Sinh bệnh học, biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán”, phần ‘Khuyết tật di truyền’.)

Tính nhạy cảm theo kiểu Mendel đối với các bệnh do mycobacteria

Các cá nhân có khiếm khuyết trong việc tạo ra hoặc phản ứng với IFN-gamma dễ bị nhiễm các bệnh do mycobacteria và Salmonella vì IFN-gamma đóng vai trò chính trong việc hoạt hóa đại thực bào và loại bỏ các mầm bệnh nội bào. (Xem “Tính nhạy cảm theo kiểu Mendel đối với các bệnh do mycobacteria: Các khiếm khuyết cụ thể”.)

Thiếu hụt thụ thể Toll-like

Khả năng nhận biết các vi sinh vật gây nhiễm trùng là bước đầu tiên và quan trọng trong việc tạo ra phản ứng miễn dịch. Thụ thể Toll-like (TLRs) là một nhóm thụ thể nhận biết các mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh (PAMPs) của vi khuẩn, vi-rút và nấm, và điều tiết hiệu ứng này. Các khiếm khuyết trong các protein đường truyền tín hiệu TLR như IL-1 receptor associated kinase 4 (IRAK-4) và myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) có liên quan đến bệnh phế cầu và tụ cầu xâm lấn, và các biến thể gây bệnh trong gen liên quan đến tín hiệu TLR3 có liên quan đến viêm não herpes 47,48. Phân tích tế bào dòng chảy (Flow cytometry) có thể được sử dụng để đánh giá phản ứng của các tế bào miễn dịch với các phối tử TLR bằng cách đo lường sản xuất cytokine nội bào (hình 22) 49,50. Tương tự, các khiếm khuyết trong các protein sửa đổi thiết yếu NF kappa-B (NEMO) hoặc protein ức chế NF-kappa-B alpha (còn gọi là inhibitor of kappa B alpha [IKBA]) có thể dẫn đến tín hiệu TLR bị lỗi, có thể được phát hiện bằng xét nghiệm này. Phân tích tế bào dòng chảy cũng có thể được sử dụng để đo sự thoái hóa của IKBA 51. Hiện chưa có nghiên cứu phân tích tế bào dòng chảy nào được biết đến để đánh giá chức năng của đường truyền TLR3. (Xem “Thụ thể Toll-like: Vai trò trong bệnh và điều trị” và “Suy giảm miễn dịch kết hợp: Tổng quan”.)

Các biến thể gây bệnh tăng chức năng trong hội chứng suy giảm miễn dịch/rối loạn điều hòa miễn dịch

Các biến thể gây bệnh điểm trong các gen phản ứng miễn dịch quan trọng, chẳng hạn như STAT1 hoặc STAT3, dẫn đến tăng tín hiệu (biến thể tăng chức năng) có thể gây ra nhiều rối loạn với các đặc điểm của suy giảm miễn dịch và tự miễn/rối loạn điều hòa miễn dịch 52,53. Sự phosphoryl hóa của STAT1 hoặc ЅTAT3 để đáp ứng với các cytokine kích hoạt các con đường này, chẳng hạn như IFN-gamma và IL-6, tương ứng, có thể được đo bằng lưu lượng kế (flow cytometry) 54. Các tế bào thường được kích thích bằng cytokine trong khoảng thời gian khác nhau, sau đó được cố định và nhuộm bằng kháng thể liên kết với các gốc phosphoryl hóa cụ thể trên các protein này (ví dụ: phosph-STAT1 hoặc phosphor-ЅTAT3) (hình 21). Bất kỳ sự giảm phosphoryl hóa nào sau khi kích thích bằng cytokine hoặc việc các protein này không khử phosphoryl hóa bình thường theo thời gian có thể hỗ trợ chẩn đoán các hội chứng này. Các xét nghiệm tương tự có thể được sử dụng để đánh giá các biến thể gây bệnh mất chức năng hoặc âm tính trội (domit-negative) trong các gen này. Về mặt lý thuyết, các xét nghiệm này có thể được sử dụng cho bất kỳ con đường tín hiệu nào dẫn đến phosphoryl hóa protein miễn là có kháng thể đặc hiệu cho protein được phosphoryl hóa. Các rối loạn tăng chức năng của ЅTAT4, STAT5 và STAT6 đã được mô tả. (Xem ‘Tính nhạy cảm Mendel đối với các bệnh mycobactérias’ ở trên.)

TÓM TẮT

TÀI LIỆU THAM KHẢO